Wilhelm Conrad Röntgen nació el 27 de marzo de 1845 en Lennep, provincia del Bajo Rin, Alemania, hijo único de un comerciante y fabricante de telas. Su madre era Charlotte Constanze Frowein, de Ámsterdam, miembro de una antigua familia Lennep afincada en Ámsterdam.
A los tres años, su familia se mudó a Apeldoorn, en los Países Bajos, donde asistió al Instituto Martinus Herman van Doorn, un internado. No mostró ninguna aptitud especial, pero sí un gran amor por la naturaleza y le gustaba vagar por el campo y los bosques. Era especialmente hábil para la fabricación de artefactos mecánicos, característica que conservó en su vida adulta. En 1862 ingresó en una escuela técnica en Utrecht, donde fue expulsado injustamente, acusado de haber realizado una caricatura de uno de los profesores, que en realidad era obra de otra persona.

En 1865 ingresó en la Universidad de Utrecht para estudiar física. Al no haber obtenido las credenciales requeridas para un estudiante regular, y al enterarse de que podía ingresar al Politécnico de Zúrich aprobando su examen, lo aprobó y comenzó allí estudios de ingeniería mecánica. Asistió a las conferencias de Clausius y también trabajó en el laboratorio de Kundt. Tanto Kundt como Clausius ejercieron una gran influencia en su desarrollo. En 1869 se doctoró en la Universidad de Zúrich, fue nombrado asistente de Kundt y lo acompañó a Wurzburgo ese mismo año y, tres años más tarde, a Estrasburgo.
En 1874 se graduó como profesor en la Universidad de Estrasburgo y en 1875 fue nombrado catedrático de la Academia de Agricultura de Hohenheim, Wurtemberg. En 1876 regresó a Estrasburgo como catedrático de Física, pero tres años después aceptó la invitación para ocupar la cátedra de Física en la Universidad de Giessen.

Tras rechazar invitaciones a puestos similares en las universidades de Jena (1886) y Utrecht (1888), aceptó la de la Universidad de Wurzburgo (1888), donde sucedió a Kohlrausch y encontró entre sus colegas a Helmholtz y Lorenz. En 1899 rechazó una oferta para la cátedra de Física en la Universidad de Leipzig, pero en 1900 la aceptó en la Universidad de Múnich, por petición especial del gobierno bávaro, como sucesor de E. Lommel. Allí permaneció el resto de su vida, aunque se le ofreció, pero la rechazó, la presidencia del Physikalisch-Technische Reichsanstalt de Berlín y la cátedra de Física de la Academia de Berlín.

El primer trabajo de Röntgen se publicó en 1870, abordando los calores específicos de los gases, seguido unos años más tarde por un artículo sobre la conductividad térmica de los cristales. Entre otros problemas, estudió las características eléctricas y del cuarzo; la influencia de la presión en los índices de refracción de diversos fluidos; la modificación de los planos de la luz polarizada por influencias electromagnéticas; las variaciones en las funciones de la temperatura y la compresibilidad del agua y otros fluidos; y los fenómenos que acompañan la propagación de gotas de aceite sobre el agua. Sin embargo, su nombre se asocia principalmente a su descubrimiento de los rayos que él llamó rayos X.

En 1895, estudiaba los fenómenos que acompañaban el paso de una corriente eléctrica a través de un gas de presión extremadamente baja. Trabajos previos en este campo ya habían sido realizados por otros científicos, gracias a los cuales, las propiedades de los rayos catódicos –nombre dado por Goldstein a la corriente eléctrica establecida en gases altamente enrarecidos por la electricidad de muy alta tensión generada por la bobina de inducción de Ruhmkorf– se habían hecho bien conocidas. Fueron los trabajos de Röntgen sobre los rayos catódicos lo llevaron al descubrimiento de un tipo nuevo y diferente de rayos.

En la tarde del 8 de noviembre de 1895, descubrió que, si el tubo de descarga se encerraba en una caja de cartón negra gruesa y sellada para impedir la entrada de luz, y si trabajaba en una habitación oscura, una placa de papel cubierta por un lado con platinocianuro de bario, colocada en la trayectoria de los rayos, se volvía fluorescente incluso a dos metros del tubo de descarga. Durante experimentos posteriores, descubrió que objetos de diferentes grosores interpuestos en la trayectoria de los rayos mostraban una transparencia variable al registrarse en una placa fotográfica. Al inmovilizar por unos instantes la mano de su esposa en la trayectoria de los rayos sobre una placa fotográfica, observó, tras el revelado, una imagen de la mano de su esposa que mostraba las sombras proyectadas por los huesos de la mano y la de un anillo que llevaba, rodeada por la penumbra de la carne, que era más permeable a los rayos y, por lo tanto, proyectaba una sombra más tenue. Este fue el primer «röntgenograma» jamás realizado. En experimentos posteriores, Röntgen demostró que los nuevos rayos se producen por el impacto de rayos catódicos sobre un objeto material. Dado que su naturaleza era desconocida en aquel entonces, los denominó rayos X. Posteriormente, Max von Laue y sus discípulos demostraron que son de la misma naturaleza electromagnética que la luz, pero se diferencian de ella únicamente en la mayor frecuencia de su vibración.

Fue colmado de numerosos honores. En varias ciudades, se bautizaron calles con su nombre, y una lista completa de premios, medallas, doctorados honoris causa, membresías honorarias y correspondientes en sociedades científicas tanto en Alemania como en el extranjero, y otros honores, llenaría una página entera de este libro. A pesar de todo esto, Röntgen conservó la característica de un hombre notablemente modesto y reservado. A lo largo de su vida conservó su amor por la naturaleza y las actividades al aire libre. Pasó muchas vacaciones en su casa de verano de Weilheim, al pie de los Alpes bávaros, donde recibió a sus amigos y realizó numerosas expediciones a las montañas. Fue un gran montañero y en más de una ocasión se vio envuelto en situaciones peligrosas. Amable y cortés por naturaleza, siempre comprendía las opiniones y dificultades de los demás. Siempre le evitó tener ayudante y prefería trabajar solo. Gran parte de los aparatos que utilizaba fueron construidos por él mismo con gran ingenio y habilidad experimental.

Röntgen se casó con Anna Bertha Ludwig, de Zúrich, a quien conoció en el café de su padre. Era sobrina del poeta Otto Ludwig. Se casaron en 1872 en Apeldoorn, Países Bajos. No tuvieron hijos, pero en 1887 adoptaron a Josephine Bertha Ludwig, que entonces tenía 6 años, hija del único hermano de la Sra. Röntgen. Cuatro años después de su esposa, Röntgen falleció en Múnich el 10 de febrero de 1923 a causa de un carcinoma intestinal.